间接 ELISA 检测抗 SARS-CoV-2 Spike RBD 抗体的结合
本文总结了以重组 SARS-CoV-2 Spike 受体结合域（receptor-binding domain, RBD）为包被抗原的间接 ELISA 流程，该流程用于评估血清或单克隆抗体与 RBD 的结合强度与效价。
主要流程和原理为：抗原包被于 96 孔板后，依次加入封闭液、梯度稀释的一抗（血清或抗体）、HRP 标记的抗人 IgG 二抗，最后以 ABTS 底物显色并在 405 nm 读取吸光度。
Note
文中以检测人源血清 IgG 结合为例（二抗为抗人 IgG-HRP）。若一抗为鼠源或其他种属抗体，将二抗换成对应的抗种属二抗即可，其余流程不变。
一、 实验原理与设计要点
间接 ELISA 通过"包被抗原 → 一抗（待测抗体）结合 → 酶标二抗识别一抗 → 底物显色"层级放大，将抗体的结合量转化为可定量的吸光度。
设计上需要特别注意三点：
- 包被抗原量不能过低：RBD 包被浓度不足时，即使血清效价较高，信噪比也会显著下降。本流程使用约 5 µg/mL 包被。
- 封闭时间对背景影响大：2% BSA 封闭 2 h 产生的背景明显低于封闭 1 h，本流程固定为室温 2 h。
- 血清起始浓度不能过稀：血清样本从 1:10（或 1:100）起始（PBS 稀释），再在 U 底 96 孔板中做梯度滴定后转移至检测板。
二、 材料、试剂与缓冲液
1. 试剂与耗材
| 物料 | 用途 | 规格/说明 |
|---|---|---|
| 重组 SARS-CoV-2 S-RBD 蛋白 | 包被抗原 | HEK293 细胞表达的可溶性 RBD |
| 96 孔酶标板 | 反应板 | Corning 9018 |
| U 底 96 孔板 | 血清/抗体梯度稀释 | Nest |
| 抗人 IgG（H+L）-HRP 二抗 | 检测抗体 | Thermo Fisher 31410（Goat anti-Human IgG (H+L), HRP） |
| ABTS 底物溶液 | 显色 | 即用型 ABTS 溶液（Thermo Fisher 002024） |
| 封闭用 BSA | 封闭液成分 | 高纯度 BSA，配成 2%（w/v） |
| 封板膜/盖 | 防蒸发 | 包被过夜与各孵育步加盖 |
| 多道移液器 | 洗涤与加样 | 8/12 道 |
| 纸巾/吸水纸 | 拍板去液 | 每次洗涤后彻底拍干 |
| 酶标仪 | 读板 | 能读 405 nm 的吸光度 |
2. 缓冲液配方
| 缓冲液 | 配方 | 用途与备注 |
|---|---|---|
| 包被缓冲液（coating buffer） | PBS | 常用配方 |
| 洗涤液 PBST | PBS（pH 7.2）含 0.05%（v/v）Tween-20 | 0.05% |
| 封闭液 | DPBS 中 2%（w/v）BSA，0.22 µm 过滤 | 同时用作二抗稀释液 |
3. 稀释液与基质
- 一抗/血清稀释：PBS（人血清首孔 1:10（或 1:100）起）。
- 二抗稀释：用封闭液（2% BSA/PBS）稀释，避免单独加 BSA。
三、 操作流程
全部孵育均在湿盒/加盖条件下进行，避免边缘孔蒸发。默认每孔终体积见各步；同一板建议做重复孔。
1. 包被（4 ℃ 过夜）
- 用包被缓冲液将 RBD 稀释至 5 µg/mL。
- 向 96 孔板加入 50 µL/孔。加样后轻拍/轻晃使液面铺匀（避免边缘挂壁）。
- 盖上封板膜，4 ℃ 孵育过夜（约 16–18 h）。
Important
若更换抗原批次或改用截短抗原，先用 2–3 个已知阳/阴性样本做浓度梯度（如 2.5/5/10 µg/mL）预实验，确认包被浓度仍能给出足够信噪比。抗原量偏低会显著压低信噪比。
2. 洗涤（3 × 200 µL PBST）
- 弃去孔内液体（直接倒出或甩出）。
- 每孔加入 200 µL PBST，随后完全去除液体：将板倒扣在干净纸巾上拍打数次，必要时轻甩 5 次后再次拍干。
- 重复洗涤共 3 次。每次都要彻底拍干，残留液会抬高背景。
3. 封闭（室温 2 h）
- 每孔加入 200 µL 封闭液（2% BSA/DPBS）。
- 盖板，室温孵育 2 h。
4. 洗涤
同步骤 2（3 × 200 µL PBST，拍干）。
5. 一抗（血清/抗体）孵育（室温 1 h）
- 在 U 底 96 孔板中用 PBS 将待测样本梯度稀释。人血清样本从 1:10 起始（按样本类型调整）。
- 将稀释好的样本按 50 µL/孔转移至已封闭的检测板。
- 盖板，室温孵育 1 h。
Tip
每板应包含：阴性对照（如已知阴性血清/无关抗体）、空白（仅 PBS，作为本底）与（可选）阳性对照。U 底板稀释后建议立即转移，避免长时间放置。
6. 洗涤
同步骤 2。
7. 二抗孵育（室温 1 h）
- 用封闭液将抗人 IgG-HRP 稀释至 1:5000。
- 每孔加入 50 µL，盖板，室温孵育 1 h。
8. 洗涤
同步骤 2（建议最后一次洗涤后拍干更彻底）。
9. 显色
- 每孔加入 100 µL ABTS 底物。
- 室温、避光孵育。设定初始 10 min，期间不时观察显色：至阴性/空白对照仍浅、阳性孔呈明显绿色时即可终止读数；显色过快则缩短时间。
- 若显色不足，可延长至 15–30 min（随时间线性增长时进行多时间点读取更稳妥）。
10. 读板
在 405 nm 读取吸光度并记录。
Note
ABTS 为终点法/动力学法均可的底物；若使用同一板做多时间点（如 10/15/20/30 min）读取，可观察是否已进入平台期。
四、 稀释方案与板布局
1. 96 孔板布局
每列对应一个样本，8 个稀释度沿行 A–H 纵向铺布（3 倍比）。第 1 列留作阴性血清对照、第 2 列作空白（PBS）对照，其余列放待测样本。
| 行 | 第 1 列（阴性血清） | 第 2 列（空白） | 第 3 列（样本 1） | 第 4 列（样本 2） | … |
|---|---|---|---|---|---|
| A | 1:10 | PBS | D1 | D1 | … |
| B | 1:30 | — | D2 | D2 | … |
| C | 1:90 | — | D3 | D3 | … |
| D | 1:270 | — | D4 | D4 | … |
| E | 1:810 | — | D5 | D5 | … |
| F | 1:2430 | — | D6 | D6 | … |
| G | 1:7290 | — | D7 | D7 | … |
| H | 1:21870 | — | D8 | D8 | … |
（D1–D8 表示 8 个 3 倍比稀释度；抗体样本的纵轴单位为 µg/mL，见下表。）
2. 稀释梯度
在 U 底 96 孔板中做 3 倍比、共 8 个点的梯度稀释，再转移至检测板。
| 样本类型 | 起始浓度/稀释度 | 8 点梯度（3 倍比） |
|---|---|---|
| 单克隆抗体 | 10 µg/mL | 10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.0137、0.0046 µg/mL |
| 血清 | 1:10（或 1:100） | 1:10、1:30、1:90、1:270、1:810、1:2430、1:7290、1:21870 |
五、 数据记录与判定
1. 数据处理
- 以空白（仅 PBS）孔均值作为本底，从所有读值中扣除。
- 以稀释度为横轴（log 坐标）、OD₄₀₅ 为纵轴绘制滴定曲线。
2. 常见质控信号
- 若阴性对照在 1:10 已明显偏高 → 洗涤不彻底或封闭不足，见"问题排查"。
- 若已知阳性样本的信号整体偏低 → 检查包被抗原浓度/活性与二抗稀释度。
六、 竞争 ELISA（变体方法）
同一抗原体系下，可通过改变检测读出方式扩展为竞争 ELISA，用于判断两株抗体是否识别相近表位，或待测抗体能否阻断某一参照结合事件。以下为依据实验记录整理的流程：
| 步骤 | 要点 |
|---|---|
| 包被 | RBD/Spike 蛋白 5 µg/mL，100 µL/孔，4 ℃ 过夜 |
| 洗涤/封闭 | PBST 3×200 µL → 2% BSA 200 µL/孔，室温 2 h |
| 一抗（预结合） | 待测抗体/血清梯度稀释（具体浓度需摸索），室温 2 h |
| 竞争抗体 | 直接加入生物素化参照抗体（不洗涤），室温 30 min；降低其浓度可让竞争更敏感 |
| 洗涤 | PBST 7 次 |
| 检测 | Streptavidin-HRP 1:5000（封闭液稀释）50 µL/孔，室温 1 h |
| 显色/读板 | PBST 洗 3 次 → ABTS 100 µL/孔 → 405 nm（可 10/20/30 min 多点读取） |
竞争值计算：竞争值 = OD(样本孔) / OD(PBS 孔) × 100%。OD 越低说明待测抗体与生物素化参照抗体的表位越重叠。
七、 问题排查
| 现象 | 可能原因 | 处理建议 |
|---|---|---|
| 信噪比低、阳性信号弱 | 包被抗原量不足/抗原活性下降 | 提高包被浓度或换新抗原批次；验证抗原纯度与正确折叠 |
| 背景高（阴性也高） | 洗涤不彻底、封闭不足、二抗过浓 | 每次拍干彻底；封闭保证室温 2 h；二抗降到 1:5000 或更低并做棋盘滴定 |
| 边缘孔读值偏高 | 蒸发/边缘效应 | 仅用中间孔加样本，外圈加 PBS 或封板 |
| 重复孔差异大 | 移液或洗涤不均 | 用多道排枪、规范拍板；样本先在 U 底板混匀 |
参考来源
- Amanat F, et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine, 2020. https://doi.org/10.1038/s41591-020-0913-5 — 间接 ELISA 检测抗 S/RBD 抗体的代表性方法。
- Stadlbauer D, et al. SARS-CoV-2 Seroconversion in Humans: A Detailed Protocol for a Serological Assay, Antigen Production, and Test Setup. Current Protocols in Microbiology, 2020. https://doi.org/10.1002/cpmc.100 — 配套的 RBD/spike 抗原生产与两段式血清 ELISA 详细方案。
- Baine C, et al. An Optimised Indirect ELISA Protocol for Detection and Quantification of Anti-viral Antibodies in Human Plasma or Serum: A Case Study Using SARS-CoV-2. Bio-protocol, 2023. https://doi.org/10.21769/BioProtoc.4905 — 以 RBD/Spike 等为包被抗原、BSA 封闭的间接 ELISA 参考方案。
- Goat anti-Human IgG (H+L), HRP — Thermo Fisher Scientific, 货号 31410。产品页：https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Human-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/31410
- ABTS, solution — Thermo Fisher/Invitrogen, 货号 002024。产品页：https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/002024
- Thermo Fisher ABTS 使用说明：https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0011191_ABTS_UG.pdf