单克隆抗体 HEK293F 瞬时表达与 Protein G 亲和纯化
单克隆抗体 HEK293F 瞬时表达与 Protein G 亲和纯化
September 3, 2026
本文整理一套在悬浮 HEK293F 细胞中瞬时表达重组单克隆抗体（IgG）并用 Protein G 亲和层析纯化的流程，覆盖：细胞转染与表达、上清收获与澄清、Protein G 结合与低 pH 洗脱（即时中和）、超滤浓缩与定量，以及 SDS-PAGE 质控和填料再生。
整套流程以 45 mL 摇瓶培养规模为例。
一、 流程概述与关键点
重组 IgG 由两个相同重链（heavy chain, HC）与两个相同轻链（light chain, LC）组成。将编码 HC 与 LC 的表达质粒共转染悬浮 HEK293F 细胞后，细胞将装配并分泌完整 IgG 至培养基；培养数日后收获上清，经 Protein G 亲和填料（结合 IgG 的 Fc 区）一步富集，再低 pH 洗脱。由于洗脱液偏酸会使 IgG 部分变性/聚集，洗脱液必须直接滴入预先装有碱性中和液的收集管，防止局部 pH 过低。
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关键成功因素：
- 转染时细胞活力要高（通常 > 90%）；
- 全程缓冲液预冷（4 ℃），避免抗体长时间处于室温；
- 低 pH 洗脱必须即时中和；
- 浓缩/换液用 30 kDa 截留超滤管，避免 IgG（约 150 kDa）损失。
二、 材料、试剂与缓冲液
1. 试剂与耗材
| 物料 | 用途 | 规格/说明 |
|---|---|---|
| 悬浮 HEK293F 细胞 | 表达宿主 | Gibco Expi293F（货号 A14527） |
| 无血清悬浮培养基 | 细胞培养 | 奥浦迈 293F Hi-exp 培养基（货号 AC601501） |
| Optimal-MEM 减血清培养基 | 稀释质粒与转染试剂 | 美仑生物（Meilunbio）PWL041（含酚红）或 PWL042（不含酚红） |
| HC 表达质粒 | 编码抗体重链 | 转染级（去内毒素），A260/280 合格 |
| LC 表达质粒 | 编码抗体轻链 | 同上 |
| 转染试剂 | 递送质粒入细胞 | 李记生物（Life-iLab）EZ Trans 细胞转染试剂（高效），货号 AC04L092（50 mL） |
| 补料液 | 延长表达 | 奥浦迈 OPM-293 ProFeed（货号 F081918-001，1000 mL）+ 葡萄糖母液（450 g/L） |
| Protein G 亲和填料 | 捕获 IgG | GenScript Protein G Resin（货号 L00209）；20% EtOH 保存，用前预冷 PBS 清洗 |
| 重力亲和层析柱 | 柱层析 | 依上清体积选柱（如 3–6 mL 柱床） |
| 30 kDa 超滤浓缩管 | 浓缩/换液 | Millipore Amicon Ultra-4（Ultracel-30K），货号 UFC803024（24 支/盒） |
| 0.45 µm 滤膜 | 上清澄清 | 或离心澄清 |
| 预染蛋白 marker、5× 上样缓冲液 | SDS-PAGE | 含还原剂 |
| 4–12% 预制胶 | SDS-PAGE | 梯度胶 |
| 考马斯亮蓝 R-250 | 胶染色 | 染色/脱色 |
2. 缓冲液配方
| 缓冲液 | 配方 | 用途 |
|---|---|---|
| PBS（预冷） | 1× PBS，pH 7.4 | 填料平衡、洗涤、浓缩后换液/定容 |
| 洗脱缓冲液（elution buffer） | Pierce IgG Elution Buffer（货号 21004，1 L；pH 2.8，即用型） | 低 pH 洗脱 IgG |
| 中和液 | 1 M Tris-HCl，pH 9.0 | 按预计洗脱体积的约 1/10 预置于收集管 |
| 再生/去污洗液 | 0.5 M Glycine，pH 2.7 | Beads 再生（去除残留结合物） |
| PBST | PBS + 0.05%（v/v）Tween-20 | Beads 再生清洗 |
| EtOH 溶液 | 70%、20%（v/v） | 填料消毒/保存（20% EtOH 4 ℃ 长期保存） |
三、 细胞准备与瞬时转染
1. 培养规模与密度
- 取活力 > 90% 的 293F 细胞，以约 1.5 × 10⁶ cells/mL 接种于摇瓶（45 mL 培养体积；加入转染体系后总体积约 50 mL），37 ℃、5% CO₂、约 120 rpm 振荡培养。
- 转染前记录细胞密度与活力，确认处于对数期。
2. 配制质粒-转染试剂复合物
- 取两个离心管，分别加入 Opti-MEM（见步骤 3 的体积）。
- 一管加入 HC 质粒，另一管加入 LC 质粒（两者摩尔数/质量比约 1:1）。
- 向其中一管 Opti-MEM 中加入 转染试剂，另一管加入质粒 DNA；将转染试剂稀释液与质粒稀释液合并，轻弹/轻吹混匀。
- 室温静置约 10 min，形成 DNA-转染试剂复合物。
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转染体系（45 mL 培养）： 2.4 mL Optimal-MEM 稀释 180 µL 转染试剂；另 2.4 mL Optimal-MEM 稀释 HC 与 LC 质粒各约 30 µg。合并后室温静置约 10 min。
3. 转染
- 将复合物逐滴缓慢加入摇瓶（边振荡边滴加，使复合物均匀分散）。
- 转染后继续培养。本记录在转染 24 h 后补加补料（2.5 mL 补料 + 0.625 mL 葡萄糖母液（450 g/L）/50 mL 体系）。
- 转染 72 h 后补加 2.5 mL 补料，不加葡萄糖。
- 第 7 天（约转染后 7 天）收获上清。
四、 上清收获与澄清
- 将培养物分装至离心管（约 45 mL/管）。
- 4 ℃ 离心去细胞（4000 g、40 min、10 ℃）。
- 取上清，经 0.45 µm 滤膜过滤，得到澄清上清，用于 Protein G 纯化。
五、 Protein G 亲和纯化
按"填料与上清批式结合 → 重力柱洗涤与洗脱"的流程进行纯化。
1. 填料准备与结合
- 取 Protein G 填料。填料以 20% EtOH 保存，使用前用预冷 PBS 洗涤数次（去除 EtOH 与杂质）。
- 按约 600 µL 填料 / 50 mL 上清 的量取用（以填料结合载量和你目标得量为准，可适当增减）。
- 将填料加入澄清上清，4 ℃ 旋转/摇动结合过夜（或至少数小时，确保充分结合）。
- 次日将含填料的悬液小心移入重力亲和层析柱，让液体自然流下，收集/弃去流出液。
2. 洗涤
- 待柱内液体流尽，用预冷 PBS 加满柱床洗涤，让液体自然流下。重复洗涤至约 10 次柱体积。
- 柱床始终不要干涸（可留薄层液体覆盖）。
3. 洗脱与中和
- 准备收集管，每管预置 1 M Tris-HCl pH 9.0，体积约为计划洗脱体积的 1/10（例如预计洗脱 900 µL，则预置约 90 µL）。
- 向柱中加入 洗脱缓冲液（50 mL 起始体系约加 900 µL；静置 3–5 min 后再打开出口收集）。
- 让洗脱液自然滴入收集管，与 Tris 液即时混合，随即颠倒混匀，防止局部 pH 过低导致抗体聚集/沉淀。
- 可重复加洗脱缓冲液 2–3 次，合并洗脱液。
六、 浓缩、置换与定量
- 将洗脱液加入 30 kDa 截留超滤管（Amicon Ultra 30K）。
- 4 ℃、4000 ×g 离心 30 min（视浓缩目标体积调整时间，避免过度离心）。
- 弃去滤出液。若需换液至 PBS：加入 预冷 PBS（记录用约 4 mL）冲洗原管壁后一并加入超滤管，重复 2–3 次，将缓冲体系置换为 PBS 并同步浓缩。
- 收集浓缩液，测 A280 计算浓度（用抗体的消光系数），并记录 A260/280 观察核酸/杂质污染情况。
- 用 PBS 将抗体调至目标浓度（一般约 2 mg/mL），分装保存（短期 4 ℃，长期冻存于 -80 ℃）。
七、 SDS-PAGE 质控
- 样品制备：将 5 µg 抗体用 PBS 稀释至 20 µL；加入 5 µL 5× 上样缓冲液（含 DTT）。
- 混匀后简短离心，95 ℃ 加热 10 min。
- 上样：预染蛋白 marker 10 µL/孔，样品 20 µL/孔。
- 电泳：4–12% 梯度胶，100 V 约 90 min（或按胶厂商建议的电压/时间，以溴酚蓝前沿跑至胶底为准）。
- 染色：取下凝胶放入容器，加考马斯亮蓝染液浸没，摇床染色 2–3 h；倒掉染液，用脱色液或自来水摇床脱色过夜。
- 拍照记录。
预期条带：
| 条件 | 预期 |
|---|---|
| 还原 | 约 50 kDa（HC）+ 约 25 kDa（LC），无高分子量聚集体条带更佳 |
八、 Protein G 填料再生与保存
纯化后按以下顺序处理填料（记录流程）：
- 柱中加满 PBS，洗涤 5 次。
- 加入 0.5 M Glycine（pH 2.7），按填料体积的 2 倍量加，孵育约 5 min，重复 2 次（去除残留结合物）。
- PBS 加满洗涤 5 次。
- 加满 PBST（0.05% Tween-20），孵育约 5 min 去除疏水杂质。
- PBS 洗涤 5 次。
- 加满 70% EtOH，孵育过夜（消毒/去污，视厂商建议）。
- PBS 洗涤 5 次，最后将填料转入 20% EtOH，4 ℃ 保存。
九、 问题排查
问题排查（Troubleshooting）
| 现象 | 可能原因 | 处理建议 |
|---|---|---|
| 得量远低于预期 | 转染效率低、细胞密度/活力不佳、收获过早 | 核对细胞活力与对数期；做 GFP/报告质粒平行转染监测效率；确认收获时间与补料 |
| 洗脱峰不明显/结合差 | 填料未平衡好、上清 pH 或盐浓度异常、填料过期 | 上清澄清后调至中性；填料预冷 PBS 充分平衡；核对填料保存状态 |
| 纯化样品浑浊/沉淀 | 洗脱低 pH 未及时中和 | 加大 Tris 体积或提前混匀；必要时洗脱后立即调 pH |
| 还原胶出现杂带/高分子量带 | 样品中残留宿主蛋白或聚集体 | 加强洗涤；结合 SEC 或进一步精纯 |
| A260/280 偏高 | 核酸或缓冲液成分干扰 | 检查洗脱与换液是否彻底；必要时用 A280 消光系数法并扣除稀释液本底 |
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AI 使用声明：本文由作者撰写，AI 工具（Claude）辅助完成初稿起草与格式整理。作者已审校全部内容，并对准确性承担最终责任。
十、 相关方法
- 纯化出的抗体可进一步用于功能评价：SARS-CoV-2 Spike 假病毒中和实验 与 间接 ELISA 检测 RBD 抗体结合。
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