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SARS-CoV-2 Spike 假病毒中和实验（包装、活力标定与中和）

SARS-CoV-2 Spike 假病毒中和实验（包装、活力标定与中和）

September 3, 2026

本文整理了一份基于 HIV 骨架的 Spike 假病毒（pseudotyped lentivirus）定量抗体中和活性的完整流程，包括三部分：(1) 在 HEK293T 中包装携带萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）报告基因的 SARS-CoV-2 Spike 假病毒；(2) 在 Huh7 细胞上测定感染活力并将不同病毒株标定到相近剂量；(3) 抗体梯度稀释后的体外中和实验与数据拟合。

假病毒系统把 SARS-CoV-2 的 Spike（S）蛋白作为包膜展示在复制缺陷的病毒颗粒表面，因此中和实验可在 BSL-2 条件下进行。

🦠
生物安全：本系统为单轮感染、复制缺陷的假病毒（基于 HIV-1 载体），但涉及重组慢病毒与含荧光素酶报告质粒的操作。请遵守你所在机构对生物安全的要求：生物安全柜内操作、含病毒废液用消毒剂（如含氯消毒液/次氯酸盐）处理后方可废弃。

一、 实验原理

  1. 假病毒颗粒：将编码 S 蛋白的包膜表达质粒与携带 Gag/Pol 与萤火虫荧光素酶报告基因的骨架质粒（本组所用 pNL4-3.Luc.R-E）共转染 HEK293T。细胞表达的 S 蛋白组装到出芽病毒颗粒表面，形成单轮感染的假病毒颗粒；其基因组不编码功能性毒力因子，只报告感染事件。
  2. 感染与报告：假病毒通过 S 蛋白与宿主受体结合进入 Huh7（或其他敏感细胞），骨架基因组进入细胞后表达萤火虫荧光素酶；加入底物后发光信号（RLU）正比于被感染细胞数量。
  3. 中和：将梯度稀释的抗体与假病毒预孵育，若抗体能阻断 S 介导的感染，则加入细胞后的 RLU 随抗体浓度升高而下降。拟合剂量-反应曲线可得半数抑制浓度（IC50）。

二、 材料、试剂与仪器

1. 质粒与细胞

物料 用途 说明
S 蛋白表达质粒 包膜质粒 编码 SARS-CoV-2 S（野生型或 VOCs 突变株）的真核表达质粒
骨架质粒 pNL4-3.Luc.R-E 报告骨架 提供 Gag/Pol 与 Firefly luciferase，缺失 NEF/VPR/VPU/VIF 等功能基因的单轮复制骨架
HEK293T 细胞 假病毒包装 贴壁培养，转染时 70–80% 汇合
Huh7 细胞 感染/中和靶细胞 96 孔板铺板后用于活力与中和检测
TransStbl3（或等效）感受态细胞 骨架质粒扩增 慢病毒骨架含长末端重复序列，用较低温度（约 30 ℃）培养以减少重组

2. 试剂、耗材与仪器

类别 物料 说明
培养基 DMEM 完全培养基 含10% FBS，293T/Huh7 维持
无血清 DMEM 转染前/感染期换液与病毒稀释用
Opti-MEM 或 PBS 转染复合物稀释用（取决于转染试剂类型）
转染 转染试剂 293T 双质粒转染（威格拉斯 VigoFect，0.4 mL/支）
消化 0.25% 胰酶-EDTA 细胞传代
病毒收获 0.22 µm 滤膜 上清过滤去碎片
检测 萤火虫荧光素酶裂解液 如 Promega E1531（Luciferase Cell Culture Lysis Reagent 5×）
荧光素酶底物 如 Promega E1501/E1500（Luciferase Assay System）
耗材 96 孔细胞培养板 Huh7 铺板
U 底 96 孔板 病毒/抗体梯度稀释与混合
96 孔白板 RLU 读数（发光不透过板壁）
10 cm 细胞培养皿 293T 包装
仪器 CO₂ 培养箱、生物安全柜 —
多模式酶标仪/发光检测仪 读 RLU

三、 假病毒包装与收获（HEK293T）

以 10 cm 细胞培养皿为一个包装单元。

1. 293T 铺板

  1. 用贴壁细胞传代法将 293T 消化成单细胞，调整密度约 6 × 10⁵ cells/mL。
  2. 每皿加入 10 mL 细胞悬液，轻晃使分布均匀。
  3. 37 ℃、5% CO₂ 培养 14–16 h，至 70–80% 汇合时转染。

2. 双质粒瞬时转染

每个 10 cm 皿（约 70–80% 汇合）用量：骨架质粒 10 µg : S 包膜质粒 20 µg（质量比 1:2）。

  1. 稀释转染试剂：取 8 µL VigoFect 加至 500 µL PBS ，混匀静置约 5 min。
  2. 稀释质粒：将 S 包膜质粒与骨架质粒加入同一管 500 µL 稀释液中，混匀静置约 5 min。
  3. 复合物：将转染试剂稀释液逐滴加入质粒稀释液，轻弹混匀，室温静置约 15 min，形成 DNA-转染试剂复合物。
  4. 转染：先将 293T 培养基换成新鲜无血清培养基（10 mL）；随后将复合物沿皿壁/四周画圈逐滴加入，轻晃均匀。
  5. 转染后 6 h 换回完全培养基，继续培养 48 h。

3. 病毒收获与储存

  1. 48 h 后收集细胞上清。
  2. 0.22 µm 滤膜过滤以去除细胞碎片。
  3. 将假病毒上清分装（如 15 mL 管，或按实验用量小份分装），标记名称与日期，−80 ℃ 保存（避免反复冻融）。

四、 病毒感染活力检测与剂量标定

包装后的假病毒在用于中和实验前需验证感染活力，并把不同病毒株/批次标定到相近的感染剂量（否则测得的中和效力会随病毒输入量漂移）。

1. Huh7 铺板（活力检测）

  1. 96 孔细胞培养板的外周一圈：即 A1–A12、H1–H12、B1–G1、B12–G12 孔中加入 150 µL/孔的 PBS。
  2. 用 DMEM 完全培养基将状态良好的 Huh7 稀释至 1 × 10⁵ cells/mL，取 100 µL/孔 加入 96 孔细胞培养板中间的 60 个孔。
  3. 37 ℃ 培养 7–8 h 后用于感染。

2. 病毒稀释与感染

  1. 在 U 底 96 孔板中用无血清 DMEM 将病毒做四个梯度：原液、2 倍、4 倍、8 倍稀释。
  2. 每孔直接加入 100 µL 病毒稀释液（不弃原有细胞培养基），37 ℃ 感染 24 h。
  3. 感染 24 h 后换回完全培养基，继续 36 h（共约 60 h 后检测）。

3. 萤火虫荧光素酶检测

  1. 弃去孔内上清。
  2. 每孔加入 50 µL 1× 细胞裂解液（将 5× 储液用去离子水稀释至 1×），摇床室温振荡裂解约 40 min。
  3. 取 40 µL 裂解液转移至 96 孔白板，加入等体积（40 µL）荧光素酶底物。
  4. 立即用酶标仪读取发光信号（RLU）。RLU 越高表示病毒感染活力越强。

4. 中和用剂量标定

用无血清 DMEM 调整各病毒株/批次，使设定体积内产生的感染信号落在同一区间（本记录将中和输入病毒校正到约 10 × 10⁴ RLU），后续中和实验的病毒量即以此确认。

五、 中和实验

1. Huh7 铺板

同第四部分：DMEM 完全培养基铺 Huh7，100 µL/孔，37 ℃ 7–8 h。

2. 病毒输入

用无血清 DMEM 将各病毒株稀释至标定的感染剂量（见四.4），备用。

3. 抗体稀释与抗体-病毒孵育

  1. 将待测单抗预调至 0.5 mg/mL（工作储液浓度）。
  2. 在 U 底 96 孔板中按下表做梯度：
孔位 操作 混合后抗体终浓度（µg/mL）
第 1 孔 196 µL 病毒 + 4 µL 抗体（0.5 mg/mL），吹打混匀 10.000
第 2–9 孔 各 120 µL 病毒 —
第 2 孔 从第 1 孔取 60 µL 加入，混匀 3.333
第 3 孔 从第 2 孔取 60 µL 加入，混匀 1.111
第 4 孔 依次 60 µL 3 倍转移 0.370
第 5–9 孔 依次 3 倍转移 0.123 / 0.041 / 0.014 / 0.005 / 0.002

（即 9 个浓度、3 倍倍比，覆盖 10 → 0.002 µg/mL。中间 60 孔设为实验孔，每浓度两重复；第 10 孔作为仅病毒对照孔。）

  1. 混合完成后，将 U 底板放入 37 ℃ 培养箱孵育 30 min（抗体与病毒预结合）。

4. 感染

  1. 每孔直接加入 100 µL 抗体-病毒混合液（不弃原有细胞培养基，孔内总体积约 200 µL），37 ℃ 感染。
  2. 24 h 后换回完全培养基，继续 36 h培养。

Note

抗体-病毒混合液直接加在原有细胞培养上（不弃旧培养基）；表中"混合后终浓度"为混合液内浓度，实际孵育时孔内总体积约 200 µL，抗体浓度需再除以约 2。

5. 读出

同四.3（弃上清 → 50 µL 1× 裂解液室温 40 min → 40 µL + 等体积底物 → 读 RLU）。

六、 数据记录与结果计算

1. 对照

对照 含义 处理
病毒对照（仅病毒，无抗体） 0% 中和（100% 感染信号） 应给出最高 RLU
细胞对照（仅细胞，无病毒） 本底 从所有读值中扣除
（可选）已知中和抗体 阳性对照 监控批间一致性

2. 中和率计算

以 mAb 为例（测血清时把"浓度"换成"稀释度"即可）：

中和率（%）= (1 − (RLU(样本) − RLU(本底)) / (RLU(病毒对照) − RLU(本底))) × 100%
  • 对每个抗体浓度计算中和率，两重复取均值。
  • 以抗体浓度（log10）为横轴、中和率（%）为纵轴作图，得到 S 形剂量-反应曲线。
  • 用四参数 logistic（4PL）非线性回归拟合（如 GraphPad Prism 的 “log(inhibitor) vs. normalized response — Variable slope”），取抑制 50% 感染信号对应的抗体浓度作为 IC50。

Note

“减本底归一化 + 四参数变斜率拟合求 IC50” 是假病毒中和数据的标准分析流程（见文末参考：Ferrara & Temperton, 2018）。若测血清并按稀释度报告，可定义 NT50 为使 RLU 相对（仅病毒孔 − 仅细胞孔）差值下降 50% 的血清稀释度（Zhang 等, STAR Protocols, 2025）。

3. 预期结果

  • 具有中和活性的抗体呈现典型的剂量依赖性抑制：低浓度接近 0%、高浓度接近 100%。
  • 无中和活性的抗体各浓度中和率均接近 0（在误差范围内）。
  • 若抗体与 RBD/受体结合阳性却不显示中和，可能因表位不阻断受体结合或病毒输入量过高（见问题排查）。

七、 问题排查与注意事项

问题排查（Troubleshooting）
现象 可能原因 处理建议
整体 RLU 很低 / 无信号 包装失败、293T 汇合度过高过低、病毒反复冻融、Huh7 状态差 收液后尽快分装 −80 ℃；转染前确保细胞处于对数生长期
阳性抗体也不中和 病毒输入量过高（抗体相对不足）、mAb 表位不阻断结合 降低病毒剂量重标定；换用已知中和阳性抗体验证体系
中和曲线不完整（顶部不到 100%） 抗体最高浓度不够 / 病毒输入过高 提高起始浓度或降低病毒输入量；延长最高浓度平台
批间差异大 病毒批次间滴度漂移、细胞批次差异 每次用同一标定靶 RLU；固定铺板密度；板内设阳性对照 mAb
RLU 背景高 裂解液/底物污染、白板污染 现配底物；用洁净的枪头
注意事项（Notes）
  • 假病毒为重组慢病毒报告系统，需按规范处理废弃物与消毒。
  • 病毒梯度滴定用的 4 个梯度（原液/2/4/8 倍）用于初筛活力；正式中和实验将不同毒株的目标 RLU 信号调整至相似的区间。
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AI 使用声明：本文由作者撰写，AI 工具（Claude）辅助完成初稿起草与格式整理。作者已审校全部内容，并对准确性承担最终责任。

八、 相关方法

其他可参考的资料

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